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非洲猪瘟作为养猪业的重大威胁，其快速准确检测至关重要。PCR荧光检测仪凭借其高灵敏度和特异性，成为防控非洲猪瘟疫情的关键工具。有些用户在使用非洲猪瘟检测仪时常会遇到一些问题，今天来给大家解答并讲讲需要注意的事项。
一、样本采集与处理
Q1：如何确保样本采集的规范性？
无菌操作：使用一次性真空采血管，采样部位需酒精消毒后采集，避免样本污染。
采样部位：优选耳缘静脉血（抗凝管）、腹股沟淋巴结或扁桃体组织，确保样本代表性。
冷链运输：样本需4℃保存，24小时内送达实验室，防止核酸降解。
Q2：样本处理中有哪些污染防控措施？
环境控制：在BSL-2实验室操作，使用超净工作台或生物安全柜。
试剂准备：试剂平衡至室温后使用，避免反复冻融导致效价下降。
阴性对照：每批次设置3个阴性对照，监测实验室污染。
二、检测操作规范
Q3：PCR反应体系构建需注意哪些细节？
加样顺序：模板RNA→预混液→酶→探针，避免气泡产生。
分装要求：使用8联管分装，每孔总体积20μL，确保反应均一性。
阳性对照：设置强弱阳性对照（1×10³、1×10⁵、1×10⁷拷贝/μL），验证检测效能。
Q4：扩增程序设置的关键参数有哪些？
预变性：95℃ 5min，激活Taq酶。
循环参数：95℃ 15s（变性）→60℃ 45s（退火延伸），40个循环。
熔解曲线：60℃→95℃（升温速率0.5℃/s），验证产物特异性。
三、结果判读与异常处理
Q5：如何解读扩增曲线和Ct值？
阳性标准：Ct值≤35，且呈典型S型扩增曲线。
可疑样本：Ct值35-40需复检，建议改用巢式PCR验证。
阴性结果：需排除采样不当或样本保存问题。
Q6：检测结果出现“翘尾”现象如何处理？
初步处理：复查原有样本，重新提取核酸验证。
深入排查：若仍出现“翘尾”，需做环境样本和阴性对照，排除实验室污染。
临床验证：结合病猪临床症状，必要时重新采样复查。
四、实验室管理要点
Q7：如何防止实验室污染？
单向操作流：试剂准备区→样本处理区→扩增区（气压递减）。
耗材处理：使用无核酸酶枪头，经UV照射后使用。
环境消毒：实验后使用专用核酸祛除剂消毒台面和设备。
Q8：仪器维护与校准有哪些要求？
定期校准：每日进行荧光本底检测，每周进行温度验证。
软件升级：定期更新分析算法和软件补丁，提升检测精度。
记录保存：详细记录实验条件、试剂批号、操作者等信息，确保结果可追溯。
五、特殊场景应对策略
Q9：环境样本检测不出内标的原因？
技术原理：非洲猪瘟试剂检测猪内源性内标，环境样本可能不含猪源细胞。
偶发检出：可能因环境样本黏附猪源性细胞，需结合流行病学调查综合判断。
Q10：检测结果与临床诊断不符如何处理？
系统分析：考虑“窗口期”、取样部位、送检时间等因素。
方法验证：采用不同试剂复检，或结合ELISA、生物学检测方法综合判断。
动态监测：对可疑猪群进行连续监测，观察病毒载量变化趋势。
通过严格执行标准化操作流程，结合质量控制措施，可确保非洲猪瘟PCR荧光检测结果的准确性和可靠性。建议实验室定期参加能力验证，持续提升检测水平，为非洲猪瘟防控提供坚实的技术支撑。
TH-H480荧光定量PCR非洲猪瘟检测仪
